食用菌培养料的灭菌就是对培养料中的微生物进行灭杀，它是对食用菌培养的必备条件，以往一般皆采用湿热灭菌方法，因为热蒸汽的穿透力强，蛋白质的凝固点随含水量的增加而降低，所以湿热灭菌是利用高温使微生物菌体蛋白质失去活性，从而达到培养料灭菌的目的。
因采用不同形式的装置、不同的灭菌温度和不同的灭菌时间及压力标准和要求，通常食用菌培养料湿热灭菌方法又分为：发酵灭菌（巴氏灭菌）、常压灭菌、常压间歇灭菌、高压蒸汽灭菌、真空脉动灭菌等方法。
1、发酵灭菌（巴氏灭菌）在食用菌生产中，常采用培养料堆制发酵的方法，由于微生物的代谢热能产生较高的温度，培养料就可以在高温作用下发生发酵腐熟，同时也灭杀了培养料中杂菌的营养体、害虫的幼虫及其卵块。
2、常压灭菌是将食用菌培养料放入常压灭菌锅中，通入正常大气压力的蒸汽进行灭菌的方法。常压灭菌的灭菌方法，正常以常压灭菌锅（灶、床）出蒸汽（100℃）开始计算时间，通常保持食用菌培养料出蒸汽（100℃）达10～16小时。常压灭菌法的缺点是灭菌时间长，能源消耗量大。
3、常压间歇灭菌是将培养料置于灭菌锅中，经100℃的热蒸汽30～120分钟，杀死细菌的营养体，然后将灭菌物取出，置于25～30℃条件下培养24小时，以诱导培养料中残留的芽孢萌发成营养体，再次放入灭菌锅内灭菌30分钟，以杀死新萌发的营养体。如此反复多次，即可杀死培养料中的芽孢和厚垣孢子等。
4、高压蒸汽灭菌是将培养料置于密封的高压锅内，通入高压高温蒸汽，可在较短的时问内达到彻底灭菌的方法。通常培养料通入1.5~1.8kg／cm2高温蒸汽，约1~1.5小时左右，培养料的心部温度可达到121℃，保温1.5~2小时，就能达到基本满意的灭菌效果，可见灭菌时间周期较短，大大提高了灭菌效率。但高压蒸汽灭菌也有缺点，培养料在灭菌锅中灭菌，常常发生局部培养料灭菌不彻底，也就是说，高压蒸汽灭菌存在灭菌死角。所以完善的高压蒸汽灭菌设施，都在高压蒸汽灭菌设备的下方设置了排冷凝水阀门外，还设置了若干个排冷气装置，以消除灭菌死角的问题。
5、真空脉动灭菌，是基于高压蒸汽灭菌方法之后改进的新方法。其工作原理，也是将培养料置于密封的高压锅中，在未通入高压高温蒸汽之前，先对高压灭菌锅抽真空，使锅内压力达到3000Pa左右时，停止抽真空，再通入高压高温蒸汽，大约35分钟锅内培养料的中心温度就可以达到55℃左右，这时，再次对高压灭菌锅抽真空，使锅内压力达到10000Pa左右时，停止对高压灭菌锅抽真空，此时锅内培养料的中心温度，大约30分钟就达到121℃,这样，再将高压灭菌锅保温1小时左右，整个灭菌过程就结束了。真空脉动灭菌具有灭菌时间短，灭菌彻底无死角，能耗低诸多优点，但真空脉动灭菌设备制造成本较大，所以设备一次性投入也就比较高。
